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环介导等温扩增技术的原理与应用
点击次数:1979 发布日期:2018-7-24  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

原理与应用

环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术是日本学者Notomi T于2000年发明的一种新的DNA扩增技术,该方法能够高效、特异、快速的在等温条件下完成。通过一系列的链置换扩增反应,该方法能够在1h内就可以将靶基因扩增109倍,当靶基因为RNA时,该方法还可以通过在反应体系中添加反转录酶而实现对RNA的扩增;在LAMP反应中,会有大量的DNA合成,因此会产生很多焦磷酸根离子,这些焦磷酸根离子可以结合溶液中的二价Mg2+形成不容的焦磷酸盐,便于对反应结果的观测,使扩增和检测一步就可以完成,大大提高检测效率。

1.1 LAMP反应的基本原理

该技术根据靶基因的6个区域设计出4条引物,包括两条内引物和两条外引物(如下图),其中内引物由靶序列正义链和反义链的两个特异区域组成,利用DNA链在60-65℃的恒温条件下处于解链和退火的动态平衡状态,在DNA聚合酶的驱动下结合靶序列启动DNA合成,由于内引物同时和双链互补,因此是形成环状结构的主要因素;外引物与内引物前端的序列互补,通过链置换DNA聚合酶的作用置换下内引物合成的DNA链并且合成自身DNA,被置换的链自身形成茎-环结构接着与内引物结合进行扩增和链置换,新合成的茎-环结构的长度是原来的二倍,如此经过滚环扩增之后形成的产物是周而复始的插入靶序列的不同长度的茎-环结构的DNA链,即由很多重复的环组成的花椰菜结构。为了提高反应速度,还可以通过引入两条环引物加快反应,环引物与合成过程中形成的环状区域互补,增加了在LAMP反应中DNA合成的起点数量,可大大缩短检测时间,提高检测效率。

R方法不同之处在于无需加热到使双链DNA解旋到两条单链的变性温度就可以驱动反应的进行,针对靶基因的6个特性性区域的引物结构如下图所示,其具体合成步骤如下:

第1阶段为起始阶段:

第一步:内引物FIP与模板链复性结合,以FIP引物中的F2区域3’端为起点,在Bst DNA聚合酶的链置换活性的驱动下合成与靶序列互补的一条新链。

第二步:F3引物结合位于FIP前端的F3c区域开始链置换DNA合成,将之前FIP合成的序列置换下来,同时与模板链相互配对,合成自身序列,形成以F3引物为起点的双链DNA;被F3引物置换下来的链成为一条单链,由于这条单链上存在自身互补的序列,因此,FIP引物5’F1c区域与这条单链上的F1区域互补,自身配对形成茎-环结构。

第三步:下游引物BIP中的B2区域与被置换下来的这条单链相结合开始DNA合成。通过这一过程,之前上游形成的环状结构恢复为线性结构,随后由下游的B3引物将其和成的单链置换下来;同时也进行自身序列的合成,从而形成由F1到B3的双链DNA。

第四步:被置换下来的单链DNA两端分别与内引物相结合,因而可以与自身配对在两端分别形成茎-环结构,被称为哑铃结构,该结构是LAMP扩增循环的起始结构。

第2阶段是扩增循环阶段:

第一步:以上述的哑铃结构F1的3’末端进行合成延伸,并且打开5’末端的环。

第二步:以茎环状结构为模板,FIP与茎环的F2c区结合,开始链置换合成;同时3’末端B1c和B1区域互补,在3’末端形成茎环结构,以自身结构为模版,B1的3’端区域为起点进行DNA合成,释放出带有FIP的互补序列。

第三步:上一步中形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA,接着BIP引物上的B2与它们杂交,启动新一轮扩增。

1.3. LAMP引物设计原则

LAMP技术扩增基因的关键是设计出4条特异性的引物,从需要扩增的靶序列中选出F3c、F2c、F1c、B1、B2、B3 六个特定的区域,利用在引物设计软件Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/e/)即可完成;在引物设计过程中,为了得到理想的引物,需要注意以下几点:

00001. 被扩增的靶序列长度最好不要超过200bp。

00002. 内引物的末端最好不要富含AT碱基对,其末端稳定性自由能(△G)值应该小于-4kcal/mol。

00003. 每条引物的Tm值应该在55~65℃之间,最大限度的发挥酶的活性。

00004. 针对靶序列的各个区域,F2区域的5’到F1区域的5’末端以及B2区域的5’末端到B1区域的 5’末端之间的距离最好在40~60bp;F2区域的5’末端到B2区域的5’末端之间的距离最好在120bp~180bp。

1.4 LAMP反应的结果观察

LAMP在反应过程中,由于其反应效率高,速度快等特点,在反应中dNTP会解离出大量的焦磷酸根离子,与溶液中的镁离子相结合生成焦磷酸镁白色沉淀,而焦磷酸镁的生成量和DNA的扩增量呈正相关,虽然普通的PCR也会产生焦磷酸盐,但其生成量很少,不能用于结果观察,因此,生成焦磷酸镁白色沉淀是LAMP反应所特有的,并且可以将这一特性运用到反应结果的检测当中去。

根据LAMP反应的这一特性,可以在反应体系中添加金属离子络合剂或金属离子指示剂,通过其结合不同金属离子而呈现不同颜色的这一特性来判断反应是否进行。钙黄绿素(Calcein)就是一中金属离子络合剂,它需要和荧光淬灭剂Mn2+一起使用,当反应体系中存在这两种物质时,随着阳性反应的进行生成大量的焦磷酸根离子,与钙黄绿素竞争结合Mn2+,从而使Calcein缺少了Mn2+而开始出现荧光,当反应结束后,阳性结果为浅绿色;在紫外灯下显荧光,而阴性反则颜色不变,仍为橙黄色。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂,当溶液中存在Mg2+时,颜色为紫红色,而随着反应的进行,由于大量焦磷酸根离子的生成与Mg2+相结合,消耗了溶液中的Mg2+,颜色会由紫红色变为天蓝色;这两种试剂都可以通过反应体系颜色的变化来判断反应是否进行,实现对反应的可视化观察,大大提高了反应的检测效率。

LAMP反应的结果是扩增出不同大小的DNA片段,同样也可以用最普通的琼脂糖凝胶电泳进行检测,向反应产物中添加EB等核酸染料,然后进行琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯照射下能够观察到大小不等的梯度条带。

实时浊度法是利用实时浊度仪通过对反应过程中溶液的浊度进行测量从而实现对LAMP反应进行实时监控,可以在电脑上直接进行结果分析,可以实现对初始模版DNA量的定量扩增;同时也可以对引物及其工作浓度,反应时间、温度等条件进行优化,从而为LAMP反应提供最优的反应环境。

2  LAMP检测方法的应用

LAMP技术自2000年出现以来,以其快速、精确、高效的特性经被广泛的应用。这项技术已经发展到商业化的检测试剂盒中,包括细菌和病毒的检测;这项技术由于其成本低,能够应用于发展中国家的基层的实验室中,尤其是传染病比较严重的地区。

Hara-Kudo 等建立了针对沙门氏菌的LAMP检测方法,并且与PCR方法相比较,其敏感性要高于PCR方法;随后,他们又针对大肠杆菌的VT基因建立了商业化的LAMP检测试剂盒,实现了对大肠杆菌的LAMP检测。Ito等报道了针对流感病毒的LAMP引物,建立了对流感病毒的LAMP检测方法;该方法的敏感性好、特异性高。Imai等人建立了检测禽流感H5型的RT-LAMP检测方法;该方法第一次报道了能够从野生禽类咽拭纸样本中检测出H5禽流感病毒,并且不能够对人流感病毒的RNA进行扩增;其敏感性是普通RT-PCR敏感性的100倍。Nkouawa 等根据 L 组织蛋白酶样半肌氨酸肤酶基因建立绦虫的LAMP诊断方法,可以用于区分猪带绦虫和牛带绦虫以及亚洲带绦虫。

由于病原微生物都有适应和变异的功能,因此不断会有新的感染性疾病的出现,能够快速、高效、特异、便捷地鉴定出这些病毒,对疫病的防控就显的尤为重要。LAMP检测技术作为一种基于核酸扩增的新的方法为鉴别微生物病原提供了很大的帮助,其操作方法简单、反应时间短,只需要在恒温的水浴锅中就可以完成反应,大大降低了检测成本,该方法已经在不同的领域针对不同的病原微生物取得了良好的效果,并且还有很多已经开发出来了相应的LAMP检测试剂盒,为疾病的鉴别诊断、预防控制做出了很大的贡献。

RT-LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)

LAMP也同样适用于RNA模板,在反转录酶和DNA聚合酶的共同作用下,实现RNA的一步扩增,无需像RT-PCR,必须经过反转录过程。LAMP反应温度在60-65 ℃,在此温度下AMV反转录酶同样具有较高的活性,对于RNA模板,其反应条件与DNA模版反应条件相同,只需在反应体系中加入AMV反转录酶;同时,也应注意环境中的RNA酶对于RNA的降解作用,在进行LAMP反应之前RNA在反转录酶的作用下首先合成cDNA,之后在Bst DNA聚合酶的作用下启动链置换反应,开始LAMP反应。

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