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数字PCR技术的发展和原理
点击次数:1989 发布日期:2018-7-24  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

数字PCR即Digital PCR(dPCR),它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR,数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。

定量PCR时,我们常常纠结一个问题,究竟是相对定量还是绝对定量呢?如今,你无需纠结了,因为数字PCR(digital PCR)来了。尽管这两种技术有些类似,都是估计起始样品中的核酸量,但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量,而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

技术发展:

20世纪末,Vogelstein 等提出数字PCR( digitalPCR,dPCR) 的概念,通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元至多包含一个拷贝的目标分子( DNA 模板) ,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。

数字PCR技术不断发展,Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR产品。

QuantaLife公司开发出的微滴数字PCR技术。该产品还获得了2011年度Frost & Sullivan北美新产品创新奖。2011年10月,Bio-Rad公司收购了QuantaLife和ddPCR技术,相继推出了QX100、QX200微滴式数字PCR系统。

与其他数字PCR技术不同,Bio-Rad对样品进行微滴化处理。据该公司基因表达部门的销售经理Richard Kurtz介绍,他们的独特优势是能够产生非常均一、重复的1纳升液滴。这样的好处是每个样品形成20,000个液滴,而其他系统只能分成760-3,000个部分。分得越多,则意味着分析越准确。

数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法,光度法基于核酸分子的吸光度来定量;实时荧光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值,Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数;数字PCR是最新的定量技术,基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量,是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法,将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中,每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后,有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号,没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积,就可以推算出原始溶液的核酸浓度。

原理:

PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。

数字PCR(Digital PCR)仪器

伯乐生命bio-rad QX200 微滴式数字PCR (ddPCR) 系统可对DNA或RNA分子进行绝对定量分析,适用于 EvaGreen 或基于探针的数字PCR应用领域。

QX200 Droplet数字PCR(Digital PCR) 系统的应用领域:

癌症生物标志物研究和拷贝数变异分析
以卓越的灵敏度和准确度测量癌症突变的变异程度、检测稀有的 DNA 靶拷贝以及解析拷贝数变异状态。
病原体检测
精确地对靶 DNA 或 RNA 分子中的细微变化进行定量分析,从而检测和监测病原体。
与新一代测序 无缝对接
无需使用标准曲线,直接对 NGS 库执行绝对定量分析。
基因表达分析
可对少量 mRNA 和 miRNA 的细微变化进行准确及重复性极佳的检测。
环境监测
使用 QX200 系统可测试多种环境样品,例如土壤和水。
食品检测
采用经过验证的 ddPCR 方法对转基因生物体 (GMO) 进行评估。

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来源:武汉尚码生物科技有限公司
联系电话:027-65522005
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