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不用做免疫共沉淀也能检测间接相互作用?
点击次数:296 发布日期:2018-12-29  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

       生物被膜是由细菌胞外大分子包裹形成的有组织的细菌群体,其通常由细胞外聚合物组成,包括蛋白质、DNA和多糖,生物被膜能够帮助细菌抵御抗生素和宿主的免疫防御机制。值得注意的是,生物被膜会附着于导尿管、心脏植入物、消毒不充分的外科手术工具等医疗器械上,从而引起医院获得性感染。

       绿脓杆菌广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道,是临床上常见的条件致病菌之一。绿脓杆菌能产生多种与毒力有关的物质,对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌强大,并能在多种环境下形成强健的生物被膜。且细菌生物被膜是细菌为适应自然环境有利于生存的一种生命现象, 因此了解生物被膜产生和维持的遗传调控具有重要意义。研究其形成机理有望找到有效的抗菌药及提高机体免疫防御能力。

       Tung T. Hoang教授等人使用Nicoya局域表面等离子共振技术探究了绿脓杆菌生物被膜形成与维持相关的复杂基因调控网络,由OpenSPR获得的结合动力学数据定量验证了转录调控因子PA1226,PA1413会同他们的目标DNA结合序列形成稳定的复合体从而调控生物被膜的形成。相关研究“Novel dual regulators of Pseudomonas aeruginosa essential for productive biofilms and virulence”发表在MOLECULAR MICROBIOLOGY。

 

       研究人员首先利用转录组分析手段筛选到上百种可能参与绿脓杆菌生物被膜形成的转录调控因子,结合结晶紫染色及体内感染实验确认了编码PA1226蛋白的基因插入缺失能够显著减少生物被膜的形成。进一步的ChIP-seq,微阵列分析及凝胶阻滞分析结果表明,存在另一个辅助调控因子介导PA1226与目标DNA间的相互作用。免疫共沉淀及质谱分析发现了PA1413可能与PA1226协同调控目标DNA。

为了验证PA1226是否与PA1413协同调控目标DNA,研究人员使用Nicoya的OpenSPR 局域表面等离子共振技术实时定量检测了他们之间的相互作用。首先在NTA芯片上偶联His-tag的PA1413蛋白,之后分别检测了PA1226, DNA,PA1226-DNA混合物与PA1413间的相互作用。当PA1226或DNA单独上样时,并未检测到相互作用,而PA1226-DNA混合物产生了非常明显的浓度依赖结合曲线,软件分析得到平衡解离常数为0.31μM,这个数据科学的证明了PA1226与PA1413协同调控目标DNA,从而揭开了生物被膜形成的机制,为抗菌药的开发或机体免疫防疫机制开启一扇大门。

OpenSPR快速证实了绿脓杆菌生物被膜形成调控需要PA1226,PA1413,DNA复合作用。

OpenSPR分子相互作用分析仪可实时无标记检测分子间的相互作用,通过数据判定分子间是间接还是直接相互作用,确定复合物之间的关系,从而更深入的阐述生命机理。

Nicoya OpenSPR 分子互作仪转录调控复合体研究中的优势:

• 实时无标记---降低实验成本,有利于检测实验的设计;

• 操作简单---1小时即可掌控;

• 完整动力学参数检测---Ka,Kd,KD;

• 芯片可再生---利于快速检测分子间直接或间接作用及复合物之间的相互作用;

• 高精准---检测不受温度、缓冲液折射率影响;

来源:普瑞麦迪(北京)实验室技术有限公司
联系电话:4006-813-863
E-mail:hzhang@premedlab.com

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